Nationella rekommendationer för fenotypning av B- och T-cellssubpopulationer med flödescytometri vid misstanke om variabel immunbrist

Inledning

Syftet med nationella rekommendationer för utvidgad immunfenotypning med flödescytometri vid misstanke om variabel immunbrist är att uppnå en likvärdig diagnostik i hela landet. Den föreslagna panelen kan med fördel även användas för diagnostik av andra former av immunbrist som omfattar B-celler.

Riktlinjerna har utarbetats i samarbete mellan Svensk förening för klinisk immunologi och transfusionsmedicin (KITM) och expertgruppen för immunologi inom EQUALIS. Riktlinjerna har granskats och justerats av kliniska immunologer och läkare med intresse för primär immunbrist i Sverige (SLIPI). Riktlinjerna har godkänts av styrelsen för KITM.

Bakgrund

Variabel immunbrist är en av de vanligaste primära immunbristsjukdomarna. Enligt internationella beräkningar är förekomsten av variabel immunbrist 2-4 individer per 10000. Gemensamt för individer med variabel immunbrist är en bristande B-cellsfunktion med sänkta nivåer av IgG, ofta i kombination med sänkta nivåer av IgA och/eller IgM. Låga nivåer av antikroppar ger en ökad känslighet för bakteriella infektioner. Graden av infektionskänslighet och orsaken till immunbristen varierar stort mellan olika individer. Vid variabel immunbrist ses också ofta en försämrad T-cellsfunktion vilket är kopplat till en ökad risk för icke infektiösa komplikationer såsom autoimmun sjukdom och granulombildning, vilket i sin tur är kopplat till ökad morbiditet och mortalitet. Om antalet CD4+ T-hjälpar celler är lågt kan begreppet LOCID (Late onset combined immunodeficiency) användas.

En standardiserad immunfenotypning av lymfocyter i perifert blod hos patienter med variabel immunbrist ger information om risk för icke-infektiösa komplikationer. För B-cellspopulationer är följande dokumenterat kliniskt viktiga att identifiera vid variabel immunbrist: switchade minnesceller (definierade som CD27+, IgD-, IgM-), aktiverade B-celler med lågt uttryck av CD21 och transitionella B-celler (1-2). På T-cellssidan är det viktigt att i första hand identifiera naiva CD4+ T-celler för riskstratifiering vid variabel immunbrist (3-4). Publicerade data om kopplingen mellan andelar regulatoriska T-hjälparceller och autoimmuna komplikationer vid variabel immunbrist är motstridiga (5). Att identifiera regulatoriska T-celler med flödescytometri är svårt, då resultatet kan variera beroende på vilka markörer, fluorokromer och gejtningsstrategier som används. Den sammantagna bedömningen är därför att det inte är nödvändigt att inkludera identifiering av regulatoriska T-celler vid utredning av variabel immunbrist. Om det finns utrymme i panelen kan i stället markör för alfa/beta T-cellsreceptor (6) och/eller aktivitetsmarkörer CD38/HLA-DR inkluderas i panelen. Väldesignade paneler för immunfenotypning kan ge underlag för beslut om genetisk immunbristutredning och värdefull information om andra immunbristsjukdomar.

Detaljerade rekommendationer för utvidgad immunfenotypning

Avgränsning

Riktlinjerna omfattar endast utvidgad fenotypning av B- och T-cells subpopulationer vid utredning av misstänkt variabel immunbrist. Plasmablaster ingår inte vid utredning av variabel immunbrist.

Kvantifiering av antal B-, T- och NK-celler med 4-6 färgs flödescytometri kan utföras även om läkare med specialistkompetens i klinisk immunologi och transfusionsmedicin inte är knuten till laboratoriet.

Personal

Laborerande personal ska vara väl förtrogen med cellulärimmunologiska metoder och flödescytometri.

Läkare med specialistkompetens i klinisk immunologi och transfusionsmedicin (eller motsvarande kompetens) och god kunskap om immunbrist samt vana att bedöma flödescytometriska analyser ska ha det medicinska ansvaret för analyserna.

Instrumentering

Utvidgad immunfenotypning vid immunbristdiagnostik ska utföras på flödescytometer med CE/IVD märkning och minst 8-kanaler utöver forward-scatter och side-scatter.

Reagens

CE-IVD märkta direktkonjugerade antikroppar ska om möjligt användas. Paneler ska utvärderas enligt lokala rutiner innan de tas i drift.

Det är inte möjligt att rekommendera vissa kloner av monoklonala antikroppar eller specifika fluorokromer, då det föreligger skillnader i instrument mellan laboratorier. Klonen kan ha betydelse för separationen av vissa populationer (t ex CCR7+ och CCR7-). Vid byte av klon och/eller fluorokrom ska verifiering utföras så att analysens riktighet inte påverkas. Laboratoriet ska ha rutiner för att observera sönderfall av tandemfluorokrom om sådan används.

Färdiga blandningar av antikroppar t ex rör med intorkade antikroppar eller egenblandade cocktails av antikroppar som bereds regelbundet rekommenderas i syfte att minska risk för misstag vid pytsning av reagens.

Utvidgad B-cellsfenotypning

CD19, CD21, CD24, CD27, CD38, IgM and IgD ska ingå i panelen. CD3 och CD45 är också av värde. Inmärkning med antikropp som detekterar IgM på cellytan kan inte utföras i helblod, utan plasman måste tvättas bort innan infärgning CD3 kan användas som stöd för gejtning av cellpopulationer och CD45 leder till bättre överensstämmelse om kvantifiering av lymfocytpopulationer utförs samtidigt. Om samma panel används för bestämning av plasmablaster ska även CD20 ingå i panelen eftersom det kan underlätta identifiering av plasmablaster som saknar uttryck av CD20.

Utvidgad T-cellsfenotypning

CD3, CD4, CD8, CCR7 och CD45RA ska ingå i panelen, men andra markörer kan också ingå. CD45 leder till bättre överensstämmelse om kvantifiering av lymfocytpopulationer utförs samtidigt. Även andra markörer så som TCRa/b, HLA-DR och CD38 kan vara av värde. Vid tillägg av markörer ska verifiering utföras för att säkerställa riktigheten för CD4+ respektive CD8+ naiva- och minnes T-celler.

Analys av data

Analysprogram ska verifieras eller valideras vid införande. Ny verifiering ska utföras vid versionsbyte. Personalen ska vara väl förtrogen med programvaran och genomgå regelbunden utbildning i analys av flödescytometriska data. Innan personal självständigt utför gejtning av data ska det säkerställas att personen har tillräcklig kompetens för uppgiften.

Bedömning av utvidgad B-cellsfenotyp bör baseras på 5000 B-celler, bedömning av utvidgad fenotyp tolkas med försiktighet om antalet B-celler understiger 1000.

En cellpopulation utgörs av minst tio celler med homogen fenotyp. För kvantifiering av cellantal ska populationen utgöras av minst 40 celler. Vid bestämning av små cellpopulationer ska rutiner finnas för kontroll av ”carry-over”, t ex genom att använda tidsaxel vid insamling av celler.

Vid bedömning av CD19+ B-celler ska följande populationer separeras:

CD19⁺CD27^–IgD⁺ Naiva B-celler

CD19⁺CD27⁺IgD^–IgM^– ”Switchade” minnes B-celler

CD19⁺CD38^–CD21^low Aktiverade B-celler

CD19⁺IgM⁺CD27^–CD38⁺CD24⁺ Transitionella B-celler

Plasmablaster har följande fenotyp: CD19^lowCD20^–IgD^–CD27^highCD38^high

Andelen plasmablaster är normalt låg och plasmablaster är inte säkert påvisbara i tillräckliga antal, vilket då får anges i svarsutlåtande.

Vid bedömning av CD3+ T-celler ska följande populationer separeras:

CD3⁺CD4⁺CCR7⁺CD45RA⁺ Naiva CD4+

CD3⁺CD4⁺CCR7⁺CD45RA^– Centrala minnes CD4+

CD3⁺CD4⁺CCR7^–CD45RA^– Effektorminnes CD4+

CD3⁺CD4⁺CCR7^–CD45RA⁺ Terminala effektorminnes CD4+

CD3⁺CD8⁺CCR7⁺CD45RA⁺ Naiva CD8+

CD3⁺CD8⁺CCR7⁺CD45RA^– Centrala minnes CD8+

CD3⁺CD8⁺CCR7^–CD45RA^– Effektorminnes CD8+

CD3⁺CD8⁺CCR7^–CD45RA⁺ Terminala effektorminnes CD8+

Svarsrutiner

Antal B-celler, antal CD4+ respektive CD8+ T-celler ska framgå i svaret. För subpopulationer av B-celler och T-celler kan andelar anges. Andelar av dessa subpopulationer anges med fördel som % av föräldrapopulationen. Det ska i svaret framgå av vilken cellpopulation som subpopulationen utgör en andel av. Cellytemarkörer ska anges med CD-kod där sådan finns. För naiva B-celler ska det framgå om transitionella B-celler räknas in i populationen. SWE-koder kan användas.

Interna och externa kontroller

Att använda traditionella interna kontroller kan vara svårt vid immunfenotypning av lymfocyter eftersom frysning och även fixering påverkar uttrycket av CD-markörer. I stället kan etablerad kunskap om hur uttrycket av ett visst protein normalt är fördelat på olika celltyper användas för att identifiera negativa respektive positiva cellpopulationer i det aktuella provmaterialet. Exempelvis kan T-celler fungera som negativ kontroll för specifika B-cellsmarkörer och vise versa. Hänsyn ska även tas till att olika cellpopulationer kan ha olika grad av autofluorescens. Laboratoriet ska ha rutiner för kontinuerlig övervakning av antikroppskonjugat för att t ex upptäcka sönderfall av tandemkonjugat.

Referenser

Wehr C, Kivioja T, Schmitt C, Ferry B, Witte T, Eren E, et al. The EUROclass trial: defining subgroups in common variable immunodeficiency. Blood 2008;111:77-85.
Warnatz, A. Denz, R. Drager, M. Braun, C. Groth, G. Wolff-Vorbeck, et al. Severe deficiency of switched memory B cells (CD27(+)IgM(-)IgD(-)) in subgroups of patients with common variable immunodeficiency: a new approach to classify a heterogeneous disease. Blood, 99 (2002), pp. 1544-1551
Malphettes, L. Gerard, M. Carmagnat, G. Mouillot, N. Vince, D. Boutboul, et al. Late-onset combined immune deficiency: a subset of common variable immunodeficiency with severe T cell defect. Clin Infect Dis, 49 (2009), pp. 1329-1338
Mouillot, M. Carmagnat, L. Gerard, J.L. Garnier, C. Fieschi, N. Vince, et al. B-cell and T-cell phenotypes in CVID patients correlate with the clinical phenotype of the disease. J Clin Immunol, 30 (2010), pp. 746-755
Azizi G, Hafezi N, Mohammadi H, Yazdani R, Alinia T, Tavakol M, et al. Abnormality of regulatory T cells in common variable immunodeficiency. Cell Immunol. (2017) 315:11–7. 10.1016/j.cellimm.2016.12.007
Warnatz K, Voll RE. Pathogenesis of autoimmunity in common variable immunodeficiency. Front. Immunol. 2012;3:210.